百日咳毒素的等电点测定及层析分离

发布于:2021-07-20 10:53:23

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西
6  8













报 ( 自然 科学 版 )  

第 4 O卷 2 0 0 4年第 4期 
Vo14   2 0   No 4 .0 04 . 

J u n l fNo we tNo ma  ie st ( t r lS in e  o r a     ̄h s  r lUnv r i Na u a  ce c ) o y

百 日咳 毒 素 的 等 电点测 定 及 层 析 分 离 
刘 国安  ,杨 晓 明  ,葛瑞 昌。 ,何 长 民 
(.西北 师 范大 学 生命 科学 学 院 ,甘 肃 兰州 1 70 7 ;2 3 00 .卫生 部 生 物制 品研 究所 ,甘肃 兰州 70 4 ; 306 

3 兰 州大学 生 命科 学学 院 ,甘肃 兰州 .
摘 要 :百 日咳 毒素 是 百 日咳杆

7 00 ) 30 0 

( r eel etsi) 生的 一种 主要毒 力 因子 ,也 是 百 日咳 菌 苗 的主要 成分之 一 . Bodtl pruss产 a  

用等 电聚 焦法测 得其 等 电点 为 p 6 8 将 百 日咳 杆 茵液体 培养 液在 等 电点 盐析后 ,通 过 DE —ehdxA5 阴 离子  H .. AE Sp ae  0 交换 剂进 一 步分 离纯化 了百 日咳毒 素. E IA测 定其 比活 力表 明 ,3批 样品 的提 纯倍 数 分别 为 14 ,13 LS . 7 . 7和 13 . .6   关键 词 :百 日咳 毒素 ;等 电点 ;DE -eh dxA5  AES p ae- 0 中图分 类号 :Q 0   53 文献 标识 码 :A  文 章 编号 :1 0 —8   2 0 ) 40 6 -3 0 19 8 X( 0 4 0 —0 80  

Th   Id t r i a i n a d p rfc to   fp r u s s t x n e p   e e m n to   n   u iia i n o   e t s i  o i  
II   u -n , Y AN G  a — n , G E Ru — h n 。 H E  a g r i 。  U G o a   Xio mi     ic a g , Ch n — n  a
( . C lg   fLi   ce c 1 ol eo   f S in e,No t we tNo ma  nv r i e e rh s  r l U ie st y,La z o   3 0 0,Ga u,Ch n   n h u7 0 7 ns ia 2 L n h u I t ut  fBilg c l o c s L n h   3 0 6, Ga s , Chn ; . a z o  nsi eo   oo ia  du t , a z ou 7 0 4 t Pr n u ia  3 o l g   fLi   in e .C l eo   f S e c ,La z o   ie st e ec n h u Un v r iy,La z o   3 0 0, Ga u Ch n ) n h u7 0 0 ns , ia  

Ab ta t Pe t s i o i  Sm an t x c fc o   r d c d b   r tla pe t si . I S ma n c m p sto   f sr c : ru sst xn i  i o i a t rp o u e   y Bo dee l  ru ss ti  i  o o iin o   p ru ss v c i e I  t i su y, t e p  e a i e   y s ee ti f c sn  i pH 6 8 At H 6 8 h   e t s i  a cn . n h s t d h   I x m n d b  io lc rc o u i g s ..  p .  t e p ru ssm e im   u ena a ti  a to t PT s f r h rp rfe   y c r ma o r p y o   e t s i  d u s p r t n  s s l  u , i  u t e   u iid b   h o t g a h   n DEAE— p a e - Se h d x  

A5   o u 0 c l mn Th   p cf   ci iy i  e e mi e   yELI A. Th   u iia in muli l  r   . 7。 1 3   n   . e s e i c a tv t  sd t r n d b   i S ep rfc t   o tp ea e1 4 . 7a d
1 3   e a a ey f rt r e s mp e . - 6 s p r t l o  h e  a ls  Ke   r s p ru ss t x n; io lc rc p i t DEA E- p a e - 0 y wo d : e t s i o i s ee ti  on ; Se h d x A5  

百 日咳是世界范围 内的儿童急性呼 吸道传 染疾 
病 , 由百 日咳 杆 菌 ( r eel etsi) 宿 主 呼  Bod tl p russ 对 a

txn,T) o i P ,并 对 其 性 质 进 行 了 研 究 . 18 9 0年 制 成  了无 细 胞 百 日咳 菌 苗 ,1 8 9 1年 起 在 日本 使 用 . 结 

吸系统 上皮 细 胞 粘 附 、定居 、繁 殖并 产生 毒 性 物 
质 ,致使 患者 发 生 以痉 挛性 咳嗽 为 典 型症 状 的疾  病. 目前 尚无有效 的治疗药物 ,此病 的预防控制主  要依赖 于菌苗 的预防接种[] 1.   全细胞 百 日咳菌苗虽然有效抑制 了百 日咳 的传  播 ,但 由于接种后 出现较严重 的副反应 ,人 们便开  始致 力于发展一种副反应低 、效力较高 的疫苗. 日   本起 步较早 ,在 2 世 纪 6 年代就开始 了对百 日咳  0 0

果表 明,无细胞百 日咳菌苗能明显地减弱百 日咳感 

染的临床症 状 ,具有 良好 的预防效果.   2 世纪 8 0 0年代 中期 ,我 国也研制成 功 了无 细 
胞百 日咳菌苗.何长民等研制 的以 F A和 P H T为主 
要抗 原 的无 细胞 百 日咳 菌 苗 ,试 验 证 明 是 完 全 有 效  

的,目前 已与 白喉 、破 伤风类毒 素被制 成新一代联  合菌苗 ,用于儿童计划 免疫 L] 3.虽然有关无细胞 百  日咳菌苗 的文献 很 多 ,但 对 P T性 质 的研究 中 ,未  见有*涞 电点 的报道.笔者用等 电聚焦法测定 了  P T的等电点 , 以此 为基 础进行 了 P 并 T的离 子交换  柱层析 ,旨在为 P T的分离 纯化 及无细胞 百 日咳菌  苗 的生产寻找高效快速 的方法作一些探讨.  

菌苗 的生物学活性 物质 和保护 性抗 原成 分 的研究 .  
1 7 年 ,S t 等人[] 94 ao 2分离得 到 了 2 主要 的保 护  个 性 抗 原 组 分——纤 维 血 凝 素 ( i metu  fa no s l h ma guii, HA )和 百 日 咳 毒 素 ( et si e g lt n F n p russ  
收 稿 日期 :20 -22 ;修 改稿 收 到 日期 :20 -83  040—6 0 40—0

作 者简 介 :刘 国安 (94 ) 16一 ,女 ,河 北滦 南人 ,副教 授 ,博 士.主 要研 究方 向为 生物 化学 与 药理 学.  

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20 0 4年 第 4期 
2 0  No 4 0 4 . 

刘 国安 等 :百 日咳毒素 的等 电点 测定 及层 析 分离 
Th   Id t r i a i n a d p rf a i n o   e t s i t x n e p   e e m n t   n   u ii t   fp r u s s o i   o c o   6  9

1 材料 和 方法 
11 P .  T的 等 电点 测 定 

位置见 图 1 .  

从 图 中 可 看 出 ,样 品胶 条 染 色 后 蛋 白带 主要 集 

中在 3 2 . m 处 ,此处梯 度胶 的 p 值为 6 6 . ~4 5c H . 


按 王重 庆『] 4 的方 法 ,凝 胶 储备 液 含 1.  丙  45
烯 酰 胺 ,0 4  甲叉 双 丙 烯 酰 胺 ,过 滤 后 4℃ 避 光  .5

70 . ,即蛋 白质 P 的等 电点是 p  . . T H 68  

保存 ,临用 前 按 质 量百 分 数 7 配 制.p   ~1    H4 0
两性 电解质 (E S RVA)按 说 明 书 加 入 ,最 终 达 到 

体 积百分数为 5 ,与 P   T标准 品 ( 日本 千 叶血清 
研 究 所 赠 ) 混 合 后 注 入 9c 垂 直 玻 管 中 ,置 电 泳   m 槽 内 ,阴 极 为 0 5mo/   OH 溶 液 ,阳 极 为 0 5 .  lL Na . 

m ll P 溶 液 ,采 用 恒 压 法 逐 步 增 大 电压 , o/ Hs O4  
至 4 0V 时 稳 压 . 当 电流 降 至 零 时停 止 电 泳 ,测 出  2 

胶 条各段 p 值 ,以胶 条距离为横坐 标 ,胶条 各段  H p 值为纵坐标作 出 p 梯 度 曲线.样 品胶 用考 马  H H 斯亮蓝染色后 ,量 出样品带 的距离 ,在距 离一H 梯  p 度曲线上可查 出样 品所在位置 的 p 值 ,即该 蛋 白 H  
的等 电点 .  
12 DE ES pa e —5 .  A -e hd xA 0柱 层 析 及 检 测 

PT / m   c

图 1 胶 条 的 p 梯度 及 Pr在胶 条 中的位置  H r

2 2 DE E S p a e — 5 .  A — e h d xA 0柱 层 析 

3 批样 品 的总 体 积 ( ) T活 力 ( /   、 mL ,P U mI   ) 总 活 力 ( 、 蛋 白 质 浓 度 (t/   、 总 蛋 白 量  U) t mI) g
( ) P 比活 力 ( mgp) mg 及 T U/  r见表 1与 表 2所 示 .  
表 1 Fr 力 与蛋 白含 量    r活

12 1 DEAE S p a e- 0柱 层 析 ..  -e h d xA5

将 San r tie—  

S h i 液体培养基 中培 养 5d的百 日咳杆 菌 培养  c ot e  
液 离 心 除 菌 (  0 / n离 心 2   n 4 ) 80 0 rmi 0 mi, ℃ ,用  1mo/   I 至 P 等 电 点 p 6 8   lL HC 调 T H . ,以硫 酸 铵 盐  析 [ . 按 赵 永 芳 [ 的 方 法 进 行 离 子 交 换 层 析 . 取      沉淀 部 分溶 于 p 8 H  O,0 0   lI . 5 mo/ Trs HCl i— ,   0 0  lL Na l 冲 液 中 ( 为 浸 提 液 ) 注 入  . 5mo/   C 缓 此 , 用 上 述 缓 冲液 * 衡 好 的 D EAE—e h d xAS S p a e- 0阴 离  子 交 换 柱 中 ,流 速 为 1    ( 0mI / h?c ) 用 上 述   m。 . 缓 冲 液 * 衡 之 后 , 以 p   . ,0 1 0 0  lL H 8 0 . ~ . 5mo/  
样 品批 号  浸提 液  层 析液  提 纯倍 数 

Tr — 1 冲液 连续 梯 度洗 脱 ,收集 洗脱 高 峰处  i HC 缓 s 溶液 ,加防腐 剂 4 ℃保存.  
1 2 2 P 活 力 澳 定— — EI S 法  采 用 改 良的  . .  T I   A I

3 讨 论 
百 日咳杆菌 可产 生多种毒力 因子 ,百 日咳毒 素  是唯一没 有争 论 的保 护性 抗 原成 分f] 9,是蛋 白性 
外 毒 素 . 在 细 菌 生 活 时 期 该 毒 素 被 分 泌 至细 胞 外 环 

Ma l i i iE o n  双抗 体夹 心法 ,将 9 孔 酶 标 板用 结合  6 珠蛋白 ( P H )包被 ,加被 测样 品、抗 P T兔 血清 ,   再加碱性磷酸酶标记 的羊抗兔抗体 ,最后 加底物对  硝基苯磷酸盐.终止反应后 于酶标 仪上 读数 ,采用  *行线数组法求 出活力.   1 2 3 蛋 白质浓度测 定 采 用改 良的染 料法『 测  .. 8  
定 ,考 马 斯 亮 蓝 G一5 20染 液 显 色 , 5 5r 波 长 处  9 i m 测 定 光 吸收 值 .  

境 中,可从薄层 静止培养 的培养液 中分离 出来. 从 
有关该毒素分 离 及纯 化方 法 的各 方 面资料 『 ̄ ] 1   分  。 析 ,P T的等 电点 可能 在 p   H 7附* ,本 实验 用 等  电聚焦法 测定 ,结果表 明 P T的等电点为 p   . . H 68  

国内外 有关纯化制备 P T的报道很多『 . S t  1 引 ao 等将 固体 培养基加水冻融 、盐 析 、浸 提 ,经淀粉* 
板 电泳后 进 行 蔗糖 梯 度 离 心 纯化 获 得 P T;Mos  re 将培 养液 上 清盐 析 、浸 提 后 ,经 C c 不 连 续 密度  sl
梯 度 离 心 ,再 进 行 S p a e — 5 e h d x G10凝 胶 过 滤 , 制  得 P T;也 有 人 通 过 HP S p ao e4 亲 和柱 或 羟   - eh rs B

2 结 果 
21 P .  T的等 电 点 测 定  电 聚焦 胶 条 距 离 与 其 p 之 间 的 关 系 及 P 的  H T

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报 ( 自然 科学 版 )  

第 4 O卷 
Vo14   .0

J u n lo   rh s  r l iest ( t r lS in e  o r a  fNo t we tNo ma  v r i Un y Na u a  ce c )

基 磷 灰石 柱 吸 附 P T,再 洗 脱 获 得 . 上 述 各 方法 均  用 于 制 备 P 纯 品 ,但 步 骤 繁 多 、工 艺 复 杂 . 目前  T 用 于 无 细胞 百 日咳 生 产 的 过 程 包 括 将 浸 提 液 二 次 盐 

poet e ni n J. If c I mu ,1 7 ,9 5 : rt i   t e[] n et m n 94 ( ) cv a g    
8 1 8 O  O — 1.

何长 民 ,陈 爱荣 ,陈* 纡 ,等. 吸 附无 细胞 百 日咳 、   白喉 、破 伤风 类 毒素 混 合 制剂 Ⅲ其 临 床人 体 接 种 反 

析后 超速离 心 ,再通过 蔗糖密度 离心除去 内毒素 的  工艺 l] L ,存在 生产周期长 ,成本高 的不足之处. 5  
离 子交 换 层 析 是 常用 的纯 化 分 离 方 法 之 一 ,广 

应 和血 清 学 效 果 观 察 报 告 I] 微 生 物 学 免 疫 学 进  - . J
展 。1 9 ,2 ( ) 5 2 . 9 8 6 4 :2 —    8

泛 用 于 多 种 生 化 物 质 的 分 离 及 制 备. D A   E E— S p ae - 5 e h d xA 0是 弱碱性 阴离子 交 换纤 维 素 ,交 联  度小 ,适 于分离分 子量范 围为 1  0  1 00 0的  00 0 0  0
蛋 白 质分 子 ( T 的 分 子 量 约 13o o . 笔 者 首 次  P 0  o )

王重庆 . 高级 生 物 化 学 实验 教 程 E ] 北 京 :北 京  M .
大 学 出版 社 ,1 9 . 95  

陈* 纡 ,王祖 森 ,何 长 民.无 细 胞 百 日咳菌 苗纯 度  和生 物 学 特 性 研 究 I - 微 生 物 学 免 疫 学 进 展 。 -I J.  
20 0 0, 2 1 8( ): 2 — 3 . 7 3 

采用 D AES p a e - 5 E -e hd xA 0作 为阴离子 交换及分离 
纯化 百 日咳毒 素. 在 p 8 0的环 境下 ,P H  . T带 负  电荷 ,与阴离 子交换剂结 合 ,采用 高浓 度盐溶液可  将其 洗脱下来.本 实验结 果显 示 ,3批样 品 的层 析 
]   ]   ]   ]  

赵永 芳. 生 物 化 学 技 术 原 理 及 应 用 [ ] M .武 汉 :武 
汉 大学 出版社 ,1 8 . 9 8 
M ao i i , M a s t f R   A sn wih iln  R s ed a d e  m eh d f t o  o  

[  3 

[  4 

[  5 

[  6 

[  7 
]  

8  [    o ¨  e z m om mu o s a9  A p[ c t n t  a  n[  m a   n y[   i n asy . 1 piai  O r ta d hu n l  

[ 


洗脱液的 比活力分 别为 2. ×1 ~ ,2 . ×1 ~ , 56 0 50 0   3 . ×1~U/   r T 收率高 于或接 * 区带 离  80 0 mgp ,P
心 的 纯化 方 法 ( 显 示 出 ) 比较 层 析 前 后 样 品 的  未 .

a h -e p t n J . J I mu lMe d, 17 , l a ft r e [ ]   m n    ̄o p oo i o 95  
83 ( ): 2 3 2 4  2— 3 .
Br d o d M     A a i n  e st em eh d f rt e a fr  M r pd a d s n ii   t o  o  h   v q a tt t n o   mir g a   q a iis o   p o en uni i   f a o c rm o u nt e   f r t i  t



 



 



 



 

 

比活 力 ,得 知 提 纯 倍 数 分 别 为 14 , 13 . 7 . 7和 
1 3 .这 表 明 阴 离 子交 换 层 析 有 效 地 分 离 了 百 日咳  .6 毒 素.  

ui i  h  r c l o  rtn d e b d g[ ] tin te pi i e fpoe — y  i i J . l g z np  i nn  
An   o h m , 1 7 , 7 al Bic e 9 6 2: 2 8 2 4  4 — 5.

杨 晓 明. 百 日咳疫 苗现状 和发 展 方 向[ ] 中国生 物  J.
制 品 学杂 志 。2 0 ,1 ( ) 2 — 3 . 0 3 6 2 :1 8 O  
La r   L, Ra ht ry U  a  E F, Gal , e a   A No e  l  J t L vl
p oc s f r rp rn     c l lr p ru ss a cn   r e s o  p e a g a a el a   e t s i v c ie i n u
c m p s d o   o - y o e i  x i so   et ss t xn o o e   fn n p r g ne t o d   fp rus i o i   o

用阴离子交换层析方法从浸提 液经 过 1 次分离 


离子交换 ,成功地分 离 了百 日咳毒 素 ,从而简化  了分 离过程 ,缩 短了时间 ,为分离提 纯百 日咳毒素 

提供了新 的途径 ,也为改善 目前成本 高 、工艺繁琐 
的生产过程 提供了新方法.离子交换层 析可采用批  量 法或柱层析 ,适用 于实 验室 分 离及 大规模 生产.  
尽 管 如此 ,经 离 子 交换 柱 层 析 后 ,有 效 成 分 仍 大 量  损 失 ,表 明层 析 条 件 还 有 待 进 一 步 摸 索 和 改 进 ,使 

a d fa n u  hm g lt i - . Moeua  n  i met s e aguin I l o n J] l lr c
I mm u o o y , 1 9 n lg 9 1, 2 8: 2 1 2 5  5— 5.

a o Y,Co l JL, S t  ,e  1 S p r to   d S t  wel     ao H ta. e a a in a   n
p rf a in f h  h m a gl iis r m Bo d t l   u i t  o t e e g ut n  fo i c o n r e el a

prus [] Ifc I mu ,18 ,4 ( ) 1—   etsi J. n et m n 93 1 1 :3 3 s  
3 0  2 .

得洗 脱成分 的 比活力和层 析后 的收率进 一步提高.  
参考 文献 :  

S o o a M , H a n c r — k r i E, Bo r ma s vbd  n e a t Po o n   re n  M ,   e  . Ra i  u f a in o   r tl   et s i  xn ta 1 pd p ri t   fBo deel p ru sst i  i c o a o b  y atr ai g le n tn   a f iy fi t   n n   ad h d p o i  y r h bc o

[ ] R b snA,rn    ,Aswo h L A P r si 1 oi o n I sL I o h  ̄    et s   u s

vci :peets ts ad ftr popc [ ] ac e r n  t u  n  uue rset J . n s a   s  
Va cn c i e, 1 8 3 1 : 1 — 2 . 9 5, ( ) 1 2 

crm t r h(] n l i hm,1 8 ,19 2 : ho ao a yJ.A   o e g p a B c 96 5 ( )  
4 2 41 . O — 1  

[ ] Sm Y 2 a   ,A a H,Sz k l L u oyoi po i   ri   uu i( ek ct s rmt g  . s— n
 ̄c r o   o d tl  p ru ss 3 Is i e t y wih o t   f B r eel e t s i , . t  d n i   t   a t

王 祖 森 ,杨 晓 明 ,何 长 民. 百 日咳 毒 素 及 其 应 用 

[] 卫生研 究 。1 9 ,2 ( 刊 )   — 14 J. 98 7增 :18 6 . 5  
(t 编辑 I任 孙 晓玲 )  


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